腫瘤類器官作為重要的體外細胞模型為腫瘤藥物研究提供了新的工具，相比于傳統的2D培養的腫瘤細胞系，3D培養的類器官可以更好地維持癌癥患者的腫瘤特征，反映腫瘤內部的異質性。因此，基于類器官模型的藥物篩選不僅可以發現新的腫瘤治療藥物，還可以用于探究不同突變類型細胞的藥物敏感性差異。盡管基于腫瘤類器官的藥物篩選助力了靶向藥物研究，但是目前藥物篩選的評價標準主要是基于增殖和凋亡等細胞表型特征，對藥物的作用機制少有分子層面的深入解析。
2023年6月22日，北京大學生物醫學前沿創新中心(BIOPIC)湯富酬團隊與北京大學第三醫院普通外科付衛團隊合作在Protein & Cell上發表了文章Drug repurposing screening and mechanism analysis based on human colorectal cancer organoids，成功建立了基于人類結直腸癌類器官模型的體外藥物篩選和藥效評價平臺，采用“老藥新用”的策略，使用小分子藥物體外篩選手段并經過免疫缺陷小鼠體內移植實驗驗證，得到多種具有潛在結直腸癌治療價值的候選藥物，并在轉錄組水平對候選藥物的作用機制進行深入解析。
該研究的主要發現有：
1.結合藥物預測方法進行基于結直腸癌類器官的藥物篩選，在335種FDA批準的治療其他疾病的臨床藥物中，篩選得到34種潛在靶向結直腸癌的候選藥物。
該研究首先利用轉錄組、外顯子組和DNA甲基化組測序技術，在多組學水平上對結直腸癌類器官的分子特征進行解析、對腫瘤類器官與患者原位腫瘤的一致性進行評估。通過對比發現，該研究構建的結直腸癌類器官可以很好地保留原位腫瘤組織的突變特征、重要信號通路的表達水平以及基因啟動子區域的甲基化水平。值得一提的是，該研究構建的8個結直腸癌類器官中有3個攜帶有KRAS突變，KRAS突變是結直腸癌中最常見的突變之一，突變頻率約為30%-50%。該研究中的結直腸癌類器官同時囊括了帶有KRAS突變和不含KRAS突變的腫瘤類型，具有很好的代表性，能夠更好地體現各種亞型結直腸癌的腫瘤特征。
為了能夠篩選到毒副作用小且具有潛在的殺傷結直腸癌細胞的藥物，除了使用經過FDA批準的治療其他疾病的藥物庫外，該研究利用已有數據庫進行條件嚴格的藥物預測，并且使用結直腸癌臨床常用藥5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)和瑞戈非尼(Regorafenib)作為陽性對照。篩選結果顯示，在包含預測藥物的共335種藥物中，34種藥物具有潛在殺傷結直腸癌類器官的能力。
2.依據轉錄組特征將結直腸癌類器官對有效的34種候選藥物的響應分為五種模式：促分化類、抑生長類、抑代謝類、促免疫響應類和抑細胞周期類。
為了進一步探究篩選得到的34種候選藥物的作用機制，該研究分別對不同患者來源的腫瘤類器官進行藥物處理，收集藥物處理后的類器官樣本進行轉錄組測序，在腫瘤相關信號通路的干擾、結直腸癌腫瘤特征基因表達、腫瘤耐藥相關基因表達以及細胞分化干性四個方面對34種藥物的作用機制進行系統的揭示。
首先，該研究通過基因集富集分析探究藥物處理后類器官的細胞增殖、免疫激活、應激及代謝等腫瘤相關通路的表達情況。結果發現，盡管篩選出的藥物都可以抑制腫瘤類器官的細胞活力，但從轉錄組水平上看，不同藥物干擾的細胞信號通路不同，說明不同藥物的作用方式不同，主要區分為5個類群，結合腸道上皮細胞標志基因的表達水平高低，該研究將5個類群進一步定義為：促分化類、抑生長類、抑代謝類、促免疫響應類和抑細胞周期類。
類群1為促分化類，該類群的特征為不同腸道細胞類型的標志基因的表達相對其他類群較高，說明腫瘤類器官的分化特征增強。提示類群1的藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也可能通過促進細胞分化進而抑制腫瘤細胞的增殖。通過基因功能富集分析，發現該類群藥物明顯抑制腫瘤細胞的有絲分裂，并且抑制Wnt信號通路的表達。同時，與腸道吸收和分泌功能相關的基因CHGB、S100A9、SLC17A7和SLC8A2的表達上調。類群2為抑生長類，轉錄組特征為應激相關通路和代謝相關通路的干擾相對其他類群較弱，通過基因功能富集分析，發現該類群明顯抑制生長因子響應通路以及MAPK信號通路。類群3為抑代謝類，轉錄組特征為與代謝相關通路如糖酵解通路的表達被抑制。該類群下調的基因富集在碳水化合物代謝和氨基酸代謝等功能中。類群4為促免疫響應類，其轉錄組特征主要表現為免疫響應和應激響應相關通路的激活。通過基因功能富集分析，發現該類群的特異性高表達基因富集在嗜中性粒細胞脫顆粒、MHC-I類分子的組裝和呈遞等功能。說明該類群的藥物不僅殺傷腫瘤細胞，同時也可能通過增強腫瘤細胞抗原遞呈的效果，釋放招募免疫細胞的信號，促進免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。類群5的細胞周期等相關信號通路的表達受到抑制的程度最強，被定義為抑細胞周期類。其轉錄組特征表現為有絲分裂紡錘體功能被抑制、鐵死亡通路激活，且腸道細胞分化相關基因的表達下調。該類群的差異低表達基因富集在細胞有絲分裂、DNA復制和細胞周期檢查點等功能上。同時，與細胞周期和DNA復制功能相關的基因CDK1、CDKN3、CENPE和TOP2A的表達下調。
根據結直腸癌類器官在藥物處理之后的轉錄組特征，該研究將腫瘤類器官對藥物的響應分為5種模式，分別為：促分化類、抑生長類、抑代謝類、促免疫響應類和抑細胞周期類。每個類群中的藥物殺傷腫瘤細胞的方式各不相同，不同類群藥物作用靶點和作用機制各有差別。
3.免疫缺陷小鼠體內移植成瘤實驗驗證發現，曲美替尼(Trametinib)、硼替佐米(Bortezomib)和菲卓替尼(Fedratinib)三種藥物具有治療結直腸癌的潛在價值。
為了進一步探究候選藥物在體內環境中的表現情況，該研究構建了基于類器官的小鼠異種移植模型(patient derived organoid-based xenografts, PDOX)。結合藥物殺傷效果和其在臨床使用中的毒性情況，該研究在每個藥物響應類群中各選取了1到2種細胞殺傷效果強、臨床使用毒性小的藥物(共7個)在PDOX模型上進行體內抑瘤實驗。通過統計處理后小鼠腫瘤的重量變化，發現經過8種藥物處理后，小鼠的腫瘤質量的中位數都降低，說明與體外的篩選實驗結果一致，篩選得到的藥物都有潛在抑制結直腸癌腫瘤的效果。其中，除臨床常用藥物5氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)之外，曲美替尼(Trametinib)、硼替佐米(Bortezomib)和菲卓替尼(Fedratinib)的抑制腫瘤的效果明顯。
綜上，該研究建立了基于人類腫瘤類器官、并且結合實驗篩選和計算預測的藥物篩選方法，成功篩選驗證得到治療結直腸癌的潛在候選藥物。同時利用轉錄組測序技術揭示了候選藥物的作用機制和作用模式，為結直腸癌治療藥物的發現提供了重要的數據支持，該研究對結直腸癌的臨床治療具有潛在應用價值。
原文鏈接：
https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwad038/7204964
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