考馬斯亮藍G-250法（Coomassie brilliant blue，G-250）是一種利用蛋白質-染料結合的原理，定量測定微量蛋白質濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和青色。該染料在游離狀態下為紅色，在酸性溶液中可與蛋白質的疏水區結合，顏色由紅色轉變成青色，其最大光吸收由 λ 465 nm變成 λ 595 nm。在一定蛋白質濃度范圍內（1-1000μg），蛋白質-染料復合物在 λ 595 nm下的吸光度與蛋白質含量成正比。蛋白質和染料結合是一個很快的過程，約2 min即可反應完全，呈現最大光吸收，并可穩定1 h，之后蛋白質-染料復合物發生聚合并沉淀出來。

1 試劑

（1）0.05 mol/L 磷酸緩沖液（PBS，pH 7.8）

（2）100 μg/ml標準蛋白質溶液

（3）考馬斯亮藍試劑

2 實驗方法

       2.1 標準曲線的繪制

        取6支試管，按下表加入各試劑，混合均勻后向各管中加入2.5 ml考馬斯亮藍試劑，搖勻并放置5 min左右，以0號試管為空白對照，在 λ 595 nm下測定吸光度。以蛋白質含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

2.2 樣品前處理

稱取0.2 g樣品置于預冷的研缽中，分三次加入6 ml（2 ml、2 ml、2 ml）預冷的磷酸緩沖液（pH 7.8），在冰浴上研磨成勻漿，轉入10 ml離心管中，低溫12000 r/min離心20min，上清夜即為蛋白粗提液。

2.3 測定方法

吸取0.5 ml蛋白粗提液（用蒸餾水適當稀釋后）放入試管中，加入2.5 ml考馬斯亮藍試劑，搖勻并放置2 min左右，以0號試管為空白對照，在 λ 595 nm下測定吸光度，通過標準曲線方程查得蛋白質含量。

2.4 計算公式

其中：

可溶性蛋白含量以每毫克每克鮮重表示（mg/g·FW）；

C為查標準曲線值（μg）；

V_t為提取液總體積（ml）；

V_s為測定時提取液用量（稀釋前）（ml）；

W為樣品鮮重（g）。