超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于動、植物體內，是一種清除超氧陰離子自由基（O₂^·-）的酶。本項目依據SOD抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產生O₂^·-，可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而 SOD可清除O₂^·-，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據此可以計算出酶活性大小。

1 試劑

（1）0.05 mol/L 磷酸緩沖液（PBS，pH 7.8）

（2）14.5 mM甲硫氨酸（Met）溶液

（3）3 mM EDTA-Na₂溶液

（4）60 μM核黃素溶液

（5）2.25 mM氮藍四唑（NBT）溶液

2 實驗方法

2.1 樣品前處理

稱取0.2 g樣品置于預冷的研缽中，分三次加入6 ml（2 ml、2 ml、2 ml）預冷的磷酸緩沖液（pH 7.8），在冰浴上研磨成勻漿，轉入10 ml離心管中，低溫12000 r/min離心20min，上清夜即為酶粗提液。

2.2 測定方法

取試管3支，1支為測定管，另外2支為對照管，按下表依次加入各溶液：

各管混勻后，將對照管1用錫箔紙包好置于暗處，其他各管于4000 Lx 光照下準確反應20 min。反應結束后，以對照管1作為空白調零，分別測定其他各管在560 nm下的吸光度。

注：可提前配置反應混合液（以60個樣品為例）：分別取Met溶液162 ml，EDTA-Na₂溶液6 ml，NBT溶液6 ml，混合后充分搖勻。取2.9 ml混合液+0.02 ml酶液+0.1 ml核黃素。

2.3 計算公式

已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50％為一個酶活性單位（U），按下式計算活性。

其中：

SOD總活性以酶單位每克鮮重表示（U/g·FW）；

SOD比活力以酶單位·每毫克蛋白表示；

A_ck為照光對照管的吸光度；

A_E為樣品管的吸光度；

V_t為提取酶液總體積（ml）；

V_s為測定時酶液用量（ml）；

W為樣品鮮重（g）；

蛋白質含量單位為mg/g。